应激性作为生物体的基本特征之一，是生物体感受外界刺激并做出应答的一种正常生理现象。
飞蛾的趋光性，榕树根的向地性，草履虫的趋化性（避开高浓度盐水），本质都是生物体应激性的直接体现。
而作为生物体的基本结构单位和基本功能单位——细胞，对外界环境的刺激会更加敏感，会因此而产生各种生理反应，造成大量信号通路以及蛋白质水平变化。那么作为科研工作者，我们该如何科学而严谨的研究细胞对刺激的响应呢？ 今天，根据SCI 文章 和Proteintech 相关实验数据，我们汇总了包括凋亡、自噬、内质网应激、细胞周期、温度、氧含量、炎症、油酸刺激，共计8大类，20余种常见的细胞刺激方法和检测方法. 文章略长，干货略多，请慢慢享用~ 1. 凋亡刺激 细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，能帮助多细胞生物去除不需要的或异常的细胞。它在生物体进化、内环境稳定以及多个系统发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。 在实验中，星孢菌素(Staurosporine)刺激和紫外线（UV）刺激是诱导细胞凋亡最常用的两种方法。而Caspase蛋白家族则是细胞凋亡过程中最关键的蛋白之一，为此可以Caspase蛋白的变化间接反应细胞凋亡的情况。 a) 星孢菌素刺激Jurkat 细胞 实验方法：以Jurkat细胞为实验对象，待细胞密度达到1.0X106个/mL 时，加入星孢菌素终浓度1μM，刺激时间6h，按时间梯度取样，以Caspase 3 抗体（Cat.No. 19677-1-AP，Proteintech）检测Caspase 3 蛋白水平的变化。 实验结果：星孢菌素刺激之后，随着刺激时间加长，全长Caspase 3 的蛋白水平不断下降；剪切体Caspase 3 的蛋白含量不断增加，间接反映了细胞凋亡的发生和加强。 b) 紫外线刺激HeLa 细胞 实验方法：以HeLa 细胞和为实验对象，待细胞汇合度达到90% 时，使用超净工作台紫外灯刺激细胞，刺激时间2h，对照组正常光照培养；以Caspase 12 抗体（Cat.No. 55238-1-AP，Proteintech）检测Caspase 12 蛋白水平的变化。 实验结果：UV刺激之后，全长Caspase 12和其剪切体蛋白水平显著上升，间接反映了细胞凋亡的发生和加强。 2. 自噬刺激 自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程。细胞借此实现自身的代谢需要和某些细胞器的更新。饥饿胁迫和雷帕霉素（Rapamycin）处理等可引起自噬（增强自噬小体形成）；氯喹或巴弗洛霉素A1等溶酶体抑制剂可以抑制自噬（抑制自噬小体和溶酶体结合）。LC3蛋白，尤其是脂化后的LC3-Ⅱ是自噬小体膜组分，可用于自噬小体标记，同时脂化后的LC3-Ⅱ和未脂化的LC3-Ⅰ二者含量的变化也可体现细胞自噬的水平。 a) 无血清培养HepG2 和HEK293 细胞 无血清培养所造成的营养缺失可诱导细胞出现自噬，形成自噬小体。低浓度氯喹可以改变溶酶体的pH值，阻止自噬小体和溶酶体的结合，从而使自噬小体处于可观察状态。 实验方法：实验组HEK293 和HepG2 无血清培养2 h 后换新鲜培养基，加入终浓度为50 μM 的氯喹培养24 h； 对照组 HEK293 和HepG2 无血清培养2 h 后换新鲜培养基，24 h 后同实验组一起收细胞。刺激完成后以LC3 抗体（Cat.No. 14600-1-AP，Proteintech）通过免疫荧光（IF）实验直接观测自噬小体的数目或WB 实验检测LC3-Ⅱ 和LC3-Ⅰ 的蛋白水平。 实验结果：IF实验显示氯喹处理的细胞中LC3蛋白由未处理时的均匀而弥散分布 转变成 聚集的环形和点状亮斑结构（自噬小体）；同时WB实验显示氯喹处理后细胞脂化的LC3-Ⅱ含量升高；两个实验均表明处理之后自噬水平大大提高。 b) 雷帕霉素刺激293T 细胞 雷帕霉素作为经典的自噬诱导剂可通过抑制mTOR信号通路进而增强自噬的发生。 实验方法：刺激前24 h 铺细胞，在细胞汇合度70%-90%开始刺激，加入终浓度分别为为20 nM、100 nM、500 nM 的雷帕霉素刺激293T ，同时还可设置时间梯度0h，6h，18h，24h；另设对照实验，即可同上实验，以LC3 蛋白通过IF 或者WB 监测细胞自噬的发生和变化。 c) 羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）增强线粒体自噬 羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）作为一种氧化磷酸化解偶联剂能抑制线粒体电子传递链，影响线粒体蛋白合成。CCCP可以促进PINK1蛋白的表达，PINK1蛋白进一步刺激泛素分子的65位丝氨酸磷酸化，募集并激活parkin，进而诱导线粒体自噬。 实验方法：刺激前24 h 铺细胞，细胞汇合度70%-90%开始刺激，使用终浓度为10 μM CCCP 刺激24 h，设置好对照 (CCCP 以DMSO 稀释，母液浓度10mM) 。以Phospho-Ubiquitin(Ser65)抗体（Cat.No.28375-1-AP, Proteintech）WB 实验检测65 位丝氨酸磷酸化的泛素分子的蛋白水平。 实验结果：CCCP刺激之后，泛素的65位丝氨酸磷酸化水平显著上升，表明线粒体自噬水平增强。 3. 内质网应激刺激 内质网应激（ER stress）表现为内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱，可激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和 caspase-12 介导的凋亡通路等，既能诱导糖调节蛋白 GRP78、GRP94 等内质网分子伴侣表达而产生保护效应 ，亦能独立地诱导细胞凋亡。在内质网应激发生时，相关蛋白ATF4 和CHOP 的表达水平会发生显著变化，故可用于内置网应激检测靶标。 a）衣霉素刺激PC-3 细胞 实验方法：衣霉素是诱导内质网应激发生的主要刺激物。实验前24h铺细胞，细胞汇合度70%-90% 开始加入衣霉素刺激，刺激浓度分别为2 μg/ml， 4 μg/ml，刺激时间24 h，对照组加入等体积DMSO。以CHOP 抗体（Cat.No. 15204-1-AP，Proteintech）WB实验检测CHOP蛋白的表达水平。 实验结果：随着衣霉素浓度升高，CHOP 蛋白的表达水平也越高，表明细胞的内置网应激水平也在提升。 b）毒胡萝卜素刺激HepG2 细胞 实验方法：毒胡萝卜素（Thapsigargin）同样可以有效诱导内质网应激发生。实验前24 h 铺细胞，细胞汇合度70%-90%时开始刺激，使用终浓度为1 μM Thapsigargin 刺激24 h，设置好对照（Thapsigargin 以DMSO 稀释，母液浓度1mM），以ELISA 试剂盒（Human ATF4 ELISA Kit，CatNo. KE00147，Proteintech）检测内质网应激相关蛋白ATF4 的表达水平变化。 实验结果：ELISA 实验结果显示，毒胡萝卜素刺激后，ATF4 的蛋白水平有显著的提升，表明内质网应激正在发生中。 4. 细胞周期 G0期，G1期，S期，G2期和M期等是细胞周期的5个阶段，调控着细胞的生长、分裂。细胞周期的调控刺激，掌控着细胞的命运。 A）Nocodazole 刺激 HeLa 细胞 B）BrdU 刺激 HeLa 细胞 D）胰岛素刺激HeLa 细胞 5. 温度刺激 鸟类和哺乳动物由于体温调节机制比较完善，能够在环境温度变化的情况下保持体温稳定，被称之为恒温动物。在受到低温环境刺激时，为维持体温恒定，生物体会通过各种通路调控细胞代谢，部分蛋白水平会发生明显改变。最典型的就是CIRBP（cold inducible RNA binding protein），为此以CIRBP作为低温响应检测指标。 实验方法：以HepG2 细胞为实验材料。取相同培养条件的细胞和相同数量的细胞，在4℃（低温）、25℃（室温）、37℃（体温）条件下培养1小时，随后收集细胞，制备裂解液，以CIRBP 抗体（Cat.No. 10209-1-AP，Proteintech）通过WB 检测CIRBP 的蛋白水平。 实验结果：随着温度降低，CIRBP 蛋白的表达量越高，表明细胞对低温的响应越强烈。 6. 氧含量刺激 氧气是维持细胞和生物体活动所需能量来源的重要物质基础，也是机体新陈代谢启动机制的关键之一。低氧环境可以增强呼吸强度，抑制生理运作；过氧化环境则会促进衰老。 实验结果：在CoCl2 处理之下，以HIF1a 抗体（Cat.No. 20960-1-AP，Proteintech）检测HIF1a，结果表明HIF1a 的蛋白水平显著上升，同时亚细胞定位由胞质向核内转移，表明细胞对低氧刺激有明显响应。 b）过氧刺激 实验方法：以HeLa 细胞和HEK293 细胞为实验对象；使用利尿酸（ethacrynic acid，EA）刺激细胞产生胁迫。刺激前24h铺细胞，细胞汇合度到70%-90% 开始刺激，加入终浓度为100 μM EA 刺激5 h 后收样，设置无刺激对照。TDP43 蛋白的磷酸化是很多神经退行性疾病的一个指标，同时它也是细胞响应过氧应激的一个重要角色。 实验结果：EA 刺激之后，以TDP-43抗体（Cat.No. 22309-1-AP，Proteintech）检测TDP43 ，结果显示TDP-43 蛋白被磷酸化（50 kDa），并被剪切成TDP35 的磷酸化片段（35 kDa），表明细胞正在响应EA 给细胞造成的刺激。 7. 炎症刺激 炎症是机体对于刺激的一种防御反应。细菌、病毒、真菌、寄生虫等生物因子，酸、碱、坏死组织的分解产物等化学性因子，高温、低温、放射线物质、紫外线和机械损伤等物理因子都可以导致炎症反应。 在实验中，我们常以下面几种化合物或者化合物组合来刺激细胞建立炎症模型。在炎症发生之后，细胞中的PD-L1 蛋白和IDO1 蛋白的水平会发生明显变化，二者可作为炎症检测靶标。 a）PMA 刺激 Jurkat 细胞 实验方法：Jurkat 细胞密度1.0 x 106 个/mL，实验组加入终浓度为10 ng/ml PMA 培养2 h（PMA 母液以DMSO 配制），对照组加入等体积DMSO，2 h 后收细胞制备裂解液。 b）LPS 刺激 HepG2 / U937 / THP-1 细胞 实验方法：刺激前24 h 铺细胞，刺激时细胞汇合度70%-90%，实验组使用终浓度为0.1 μg/ml LPS 刺激18-24 h，设置无刺激对照。 c）TNF-α 刺激 HUVEC 细胞 实验方法：刺激前24 h 铺细胞，刺激时细胞汇合度70%-90%，实验组使用终浓度为10 ng/ml 刺激18 h，设置无刺激对照。 d）PHA+LPS 共刺激 实验方法：细胞密度0.5x106个/ml，6孔板每孔细胞总量1 x 106个，PHA终浓度10 μg/ml ，LPS终浓度 50 ng/ml ；刺激时间分别为：PHA 30min+LPS 10min；PHA 1h +LPS 30min； PHA 1d + LPS 2h；PHA 2d +LPS 1d；PHA 3d +LPS 2d。 e）CD3 单抗刺激 Jurkat 细胞（T细胞活化） 实验方法：刺激时Jurkat 密度1.0 x 106 个/ml，实验组加入CD3 单抗浓度15 μg/ml，刺激6 h 后收细胞，设置无刺激对照。 f）IFN-gamma 刺激 A375 / A549 / HeLa 细胞 实验结果：以IFN-gamma 刺激 A375 / A549 / HeLa 细胞为例，在刺激之后，细胞中的PD-L1 和IDO1 的蛋白水平显著上升，表明细胞正在发生炎症反应。 8. 油酸刺激 脂滴是细胞内中性脂的储存的主要场所，是脂代谢的研究材料。用油酸（Oleic acid）刺激细胞可以诱导脂滴的形成。ADRP/Perilipin 2 是脂滴的标志物。通过IF 实验利用ADRP 抗体可以很好地展示细胞中的脂滴。 油酸刺激 实验方法：实验前24 h 铺细胞，细胞汇合度70%-90%开始刺激，使用终浓度为600 μM 的油酸刺激19 h，设置对照。以ADRP 抗体（Cat.No. 15294-1-AP，Proteintech）检测该蛋白的亚细胞定位。 实验结果：油酸刺激之后，细胞胞质中出现大量圆环状的结构，表明在油酸刺激下，细胞中的脂滴数量有显著上升。
